Trastuzumab w TNBC: przełom dzięki nanonośnikom pH-czułym

Czy trastuzumab może działać w potrójnie ujemnym raku piersi?

Rak piersi pozostaje najczęściej diagnozowanym nowotworem na świecie, a potrójnie ujemny rak piersi (TNBC) stanowi 15-20% nowych przypadków. TNBC charakteryzuje się brakiem ekspresji receptorów estrogenowych (ER), progesteronowych (PR) oraz nadekspresji receptora Her2, co uniemożliwia zastosowanie standardowych terapii celowanych. Pacjentki z TNBC mają gorsze rokowanie ze względu na wyższą agresywność biologiczną, zwiększoną skłonność do przerzutów oraz ograniczone opcje terapeutyczne – pozostaje głównie chemioterapia systemowa.

Trastuzumab (Tzm), humanizowane przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko receptorowi Her2, jest standardem w leczeniu nowotworów piersi Her2-dodatnich. Dotychczas uważano, że Tzm nie przynosi korzyści pacjentkom z rakiem Her2-negatywnym. Jednak najnowsze dane sugerują, że efekty trastuzumabu w liniach komórkowych Her2-negatywnych mogą zależeć od fosforylacji Her2, a trastuzumab deruxtecan wykazuje skuteczność w nowotworach Her2-low.

Zespół badaczy opracował nowe nanostruktury – micele pH-czułe (PEG-PHis) sprzężone z trastuzumabem – które uwalniają lek przy pH 7,2, charakterystycznym dla tkanki sąsiadującej z guzem pierwotnym oraz przerzutów. Niespodziewanie okazało się, że trastuzumab związany z micelami (Tzm-PEG-PHis) znacząco obniża żywotność linii komórkowych TNBC, podczas gdy wolny Tzm nie wykazuje takiego działania.

Jak zaprojektowano nanostruktury i modele badawcze?

Micele pH-czułe zostały zsyntetyzowane z kopolimeru blokowego poli(L-histydyny)-poli(glikolu etylenowego) (PEG-PHis), gdzie jednostka PEG miała masę 2 kDa, a łańcuch poli(L-histydyny) składał się z 32 monomerów. Trastuzumab kowalencyjnie sprzęgano z powierzchnią miceli za pomocą linkera sulfo-SMCC oraz tiolowanego przeciwciała. Morfologię miceli analizowano metodą STEM – średnica miceli wynosiła około 60 nm przed funkcjonalizacją i wzrosła do około 104 nm po przyłączeniu trastuzumabu.

Badania in vitro przeprowadzono na ludzkich komórkach TNBC (MDA-MB-231), mysich komórkach TNBC (4T1) oraz prawidłowych komórkach nabłonka piersi (MCF-10A) jako kontroli. Oceniano żywotność komórek, aktywność mitochondrialną, proliferację (test EdU), migrację i inwazję oraz zdolność do tworzenia mammosfer (model 3D oceniający populację komórek macierzystych nowotworowych). Dodatkowo zastosowano model 3D w Matrigelu – zarówno monokulturę, jak i kokulturę z fibroblastami i komórkami śródbłonka (HUVEC).

Model in vivo obejmował myszy BALB/c, którym wstrzykiwano komórki 4T1 do poduszki tłuszczowej gruczołu sutkowego. Leczenie rozpoczynano 2 tygodnie po inokulacji komórek nowotworowych, stosując dwie iniekcje dootrzewnowe tygodniowo (2 µg Tzm-PEG-PHis na mysz, co odpowiada 0,2 mg/kg m.c./tydzień). Myszy uśmiercano 5 tygodni po inokulacji, oceniając biodystrybucję (IVIS Spectrum), histopatologię (barwienie HE) oraz ekspresję markerów molekularnych metodą immunohistochemii (IHC) i Western blot.

Czy Tzm-PEG-PHis wpływa na żywotność i proliferację komórek TNBC?

W hodowlach 2D oceniano żywotność komórek po 72 h inkubacji z różnymi stężeniami Tzm-PEG-PHis (0,25–4 µg/mL) oraz wolnym trastuzumabem. Stężenia 2, 1 i 0,5 µg/mL Tzm-PEG-PHis wykazywały podobną skuteczność w redukcji żywotności komórek MDA-MB-231, natomiast 0,25 µg/mL nie wywierało efektu. Wolny trastuzumab oraz puste micele (PEG-PHis) nie obniżały żywotności komórek TNBC.

Równolegle badano aktywność mitochondrialną – kluczowy wskaźnik metabolizmu komórkowego i apoptozy. W liniach TNBC aktywność mitochondrialna była znacząco obniżona wyłącznie w grupach leczonych Tzm-PEG-PHis, co korelowało z danymi dotyczącymi żywotności. W prawidłowych komórkach MCF-10A nie zaobserwowano zmian.

Test EdU (analog tymidyny inkorporowany do DNA podczas syntezy) wykazał, że odsetek proliferujących komórek wynosił około 76% w nieleczonych MCF-10A, 69% po leczeniu Tzm-PEG-PHis, ale tylko 22% w leczonych MDA-MB-231 i 37% w 4T1. Dodatkowo analiza fluorescencyjna ujawniła zmniejszenie rozmiaru jąder komórkowych w leczonych liniach TNBC, co sugeruje zaawansowane stadium apoptozy.

„Nasze wyniki sugerują, że trastuzumab sprzężony z micelami nie tylko hamuje proliferację, ale także indukuje apoptozę w komórkach TNBC” – piszą autorzy badania.

Jak Tzm-PEG-PHis wpływa na zdolności przerzutowe komórek TNBC?

Testy migracji i inwazji wykazały, że Tzm-PEG-PHis w stężeniu 2 µg/mL silnie hamuje te procesy w liniach TNBC, podczas gdy nie wpływa na komórki MCF-10A. Liczba komórek migrujących i inwazyjnych była znacząco niższa w grupach leczonych w porównaniu z kontrolą (p < 0,05). Migracja wymaga jedynie ruchu komórek po podłożu, natomiast inwazja jest procesem bardziej złożonym, obejmującym degradację macierzy zewnątrzkomórkowej i przenikanie przez błonę podstawną.

Test mammosfer, który ocenia populację komórek macierzystych nowotworowych (CSC), wykazał dramatyczną redukcję średniego pola mammosfer po leczeniu Tzm-PEG-PHis w stężeniach 2 i 4 µg/mL. Wolny trastuzumab, nawet w dawce 4 µg/mL, nie wpływał na tworzenie mammosfer. Komórki macierzyste nowotworowe są odpowiedzialne za inicjację guza, progresję, przerzuty oraz oporność na leczenie – ich eliminacja może zapobiegać nawrotom choroby.

W modelu 3D Matrigel (monokultura) komórki TNBC tworzyły duże, inwazyjne sferoidy z licznymi rozgałęzieniami. Po trzech tygodniowych leczeniach Tzm-PEG-PHis sferoidy były wyraźnie mniejsze, mniej zwarte i prezentowały dramatycznie mniej projekcji inwazyjnych. Efekt był silniejszy w ludzkiej linii MDA-MB-231 niż w mysiej 4T1, co może wynikać z różnic w tempie proliferacji lub z ograniczonej interakcji humanizowanego przeciwciała z myszymi komórkami.

W kokulturze z fibroblastami i komórkami HUVEC – modelującej mikrośrodowisko guza – sferoidy TNBC wykazywały zwiększoną inwazyjność w porównaniu z monokulturą. Leczenie Tzm-PEG-PHis również w tym modelu znacząco hamowało formowanie sferoidów i ich rozgałęzień, co potwierdza skuteczność terapii w bardziej złożonym kontekście tkankowym.

Jakie efekty terapeutyczne zaobserwowano w modelu zwierzęcym?

Komórki 4T1 wstrzyknięto do poduszki tłuszczowej gruczołu sutkowego myszy BALB/c. Po 2 tygodniach rozpoczęto leczenie dootrzewnowe – podawano Tzm-PEG-PHis znakowany rodaminą B (Tzm-PEG-PHis-RB) dwa razy w tygodniu przez 3 tygodnie. Grupy kontrolne otrzymywały wolny trastuzumab lub puste micele z rodaminą (PEG-PHis-RB).

Analiza biodystrybucji metodą IVIS Spectrum wykazała, że fluorescencja rodaminy była wykrywalna w wątrobie i płucach w obu grupach leczonych micelami, natomiast w nerkach – tylko w grupie otrzymującej nietargowane micele, co sugeruje ich wydalanie. Najsilniejszy sygnał fluorescencyjny obserwowano w guzach pierwotnych myszy leczonych Tzm-PEG-PHis-RB, co potwierdza celowane gromadzenie nanostruktur w tkance nowotworowej dzięki interakcji trastuzumabu z receptorem Her2 oraz uwalnianiu ładunku przy niższym pH guza.

Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) ujawniło obecność przerzutów do płuc we wszystkich grupach, jednak w grupie leczonej Tzm-PEG-PHis-RB przerzuty były znacząco mniejsze. Masa płuc i śledziony była niższa w grupie leczonej w porównaniu z nieleczoną, choć nie osiągnęła wartości obserwowanych u zdrowych myszy. Analiza przeżycia wykazała wydłużenie czasu przeżycia w grupie leczonej Tzm-PEG-PHis-RB. Nie zaobserwowano natomiast istotnej redukcji masy guzów pierwotnych.

Immunohistochemia (IHC) wykazała, że leczenie Tzm-PEG-PHis-RB znacząco obniżało ekspresję kluczowych markerów molekularnych związanych z proliferacją i przerzutami. Ekspresja Akt3 – kinazy zaangażowanej w proliferację i przeżycie komórek – była obniżona w przerzutach płucnych, ale nie w guzach pierwotnych, co wyjaśnia brak redukcji masy guza pierwotnego. Fosforylowana postać kinazy ERK1/2 (pERK1/2), kluczowego elementu szlaku RAS/MEK/ERK promującego proliferację i EMT, była znacząco obniżona zarówno w guzach pierwotnych, jak i przerzutach.

Vimentyna – marker fenotypu mezenchymalnego związany z migracją i inwazyjnością – oraz receptor Axl, nadekspresjonowany w TNBC i mediujący sygnały wzrostowe, również wykazywały obniżoną ekspresję po leczeniu Tzm-PEG-PHis-RB. Test TUNEL, oceniający apoptozę ex vivo, nie wykazał różnic w guzach pierwotnych, ale ujawnił znacząco więcej komórek apoptotycznych w przerzutach płucnych grupy leczonej.

Jaki mechanizm molekularny odpowiada za działanie Tzm-PEG-PHis?

Western blot z homogenatów komórkowych potwierdził wyniki IHC – leczenie Tzm-PEG-PHis obniżało ekspresję Akt3, pERK1/2, vimentyny i Axl w liniach TNBC, ale nie w prawidłowych komórkach MCF-10A. Równocześnie obserwowano wzrost ekspresji E-kadheryny (marker nabłonkowy) oraz β-kateniny, co sugeruje indukcję przejścia mezenchymalno-nabłonkowego (MET) zamiast częściowego EMT.

E-kadheryna jest kluczowym białkiem adhezyjnym utrzymującym integralność tkanki nabłonkowej. Jej utrata w procesie EMT umożliwia komórkom nabłonkowym uzyskanie fenotypu mezenchymalnego i zdolności do migracji. Przywrócenie ekspresji E-kadheryny oraz β-kateniny, przy jednoczesnej redukcji vimentyny, wskazuje na odwrócenie fenotypu mezenchymalnego. Wcześniejsze badania wykazały, że inhibicja szlaku MAPK/ERK może przywracać połączenia międzykomórkowe E-kadheryny i morfologię nabłonkową.

Aby zbadać rolę heterodimeru Her2/Axl w mediowaniu efektów Tzm-PEG-PHis, zastosowano komórki TNBC z wyciszonym genem Axl (shAxl2). W modelu 3D Matrigel komórki shAxl2 tworzyły mniejsze sferoidy z mniejszą liczbą projekcji. Po jednorazowym leczeniu 4 µg/mL Tzm-PEG-PHis sferoidy shAxl2 były praktycznie nieobecne, a na Matrigelu pozostawały jedynie szczątki komórkowe. Sugeruje to, że trastuzumab sprzężony z micelami blokuje interakcję receptora Her2 z partnerami heterodimeru (Axl, EGFR), uniemożliwiając aktywację szlaków sygnałowych zależnych od ligandów.

„Obecność miceli może zapobiegać interakcji sąsiednich receptorów Axl lub EGFR z ich ligandami, blokując oba szlaki sygnałowe” – konkludują autorzy.

Co te odkrycia mogą zmienić w praktyce onkologicznej?

Potrójnie ujemny rak piersi pozostaje wyzwaniem terapeutycznym ze względu na agresywny przebieg i ograniczone opcje leczenia. Pacjentki z TNBC nie kwalifikują się do terapii celowanych skierowanych przeciwko receptorom hormonalnym (ER, PR) ani Her2. Standardem pozostaje chemioterapia systemowa, która wiąże się z istotnymi działaniami niepożądanymi i często prowadzi do rozwoju oporności.

Wyniki przedstawionego badania sugerują, że trastuzumab sprzężony z pH-czułymi micelami może stanowić nową opcję terapeutyczną dla pacjentek z TNBC. Kluczowym odkryciem jest fakt, że Tzm-PEG-PHis działa skutecznie w komórkach Her2-negatywnych, podczas gdy wolny trastuzumab nie wykazuje takiego efektu. Mechanizm działania wydaje się obejmować blokowanie heterodimeru Her2/Axl oraz inhibicję szlaków pERK1/2 i Akt3, co prowadzi do zahamowania proliferacji, migracji, inwazji oraz indukcji apoptozy.

Dodatkowo Tzm-PEG-PHis wykazuje zdolność do eliminacji komórek macierzystych nowotworowych (CSC), co jest szczególnie istotne z perspektywy zapobiegania nawrotom i przerzutom. CSC są odpowiedzialne za oporność na chemioterapię i stanowią rezerwuar komórek zdolnych do inicjowania nowych ognisk nowotworowych.

Potencjalne korzyści kliniczne obejmują możliwość rozszerzenia wskazań do stosowania trastuzumabu na pacjentki z Her2-negatywnym rakiem piersi, w tym TNBC. Zastosowanie nanostruktur pH-czułych może również umożliwić obniżenie dawki leku przy zachowaniu skuteczności terapeutycznej, co mogłoby zmniejszyć toksyczność systemową. Micele mogą być dodatkowo obciążane innymi substancjami czynnymi (np. doksorbucyną), co pozwala na personalizację terapii w zależności od profilu molekularnego nowotworu.

Jakie są ograniczenia badania i kierunki dalszych prac?

Autorzy podkreślają, że badanie opiera się na ograniczonej liczbie modeli – zastosowano pojedyncze linie komórkowe reprezentujące TNBC (MDA-MB-231, 4T1) oraz jeden model in vivo. TNBC jest grupą heterogenną, obejmującą różne podtypy molekularne o odmiennych profilach ekspresji genów i receptorów powierzchniowych. Wyniki uzyskane na wybranych liniach komórkowych mogą nie odzwierciedlać pełnej różnorodności klinicznej TNBC.

Model in vivo wykorzystywał myszy immunokompetentne (BALB/c), co pozwoliło ocenić interakcje z układem odpornościowym, jednak liczba zwierząt w każdej grupie była ograniczona zgodnie z zasadą 3R (replacement, reduction, refinement). Konieczne są dalsze badania z wykorzystaniem większej liczby zwierząt, różnych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentek (PDX – patient-derived xenografts) oraz oceny długoterminowych efektów terapii.

Innym ograniczeniem jest fakt, że humanizowany trastuzumab może wykazywać ograniczoną skuteczność w interakcji z myszymi komórkami, co mogło wpłynąć na różnice w odpowiedzi między ludzkimi a myszymi liniami TNBC. Ponadto brak istotnej redukcji masy guzów pierwotnych sugeruje, że zastosowana dawka (0,2 mg/kg m.c./tydzień) może być zbyt niska lub że mechanizm działania wymaga dalszej optymalizacji.

Autorzy wskazują również na potrzebę badań nad modyfikacją ładunku miceli w zależności od specyfiki receptorów na powierzchni komórek nowotworowych. Różne linie TNBC mogą wyrażać różne wzorce receptorów, co wymaga personalizacji terapii poprzez dobór odpowiednich biomolekuł aktywnych ładowanych do nanostruktur.

Przed wdrożeniem do praktyki klinicznej niezbędne będą badania fazy I/II oceniające bezpieczeństwo, farmakokinetykę, biodostępność oraz optymalną dawkę Tzm-PEG-PHis u pacjentek z TNBC. Kluczowe będzie również określenie biomarkerów predykcyjnych odpowiedzi na terapię oraz ocena potencjalnych działań niepożądanych związanych z zastosowaniem nanostruktur.

Czy trastuzumab sprzężony z micelami może zmienić leczenie TNBC?

Badanie wykazało, że trastuzumab sprzężony z pH-czułymi micelami (Tzm-PEG-PHis) skutecznie hamuje proliferację, migrację, inwazję oraz zdolność do tworzenia mammosfer w komórkach potrójnie ujemnego raka piersi, podczas gdy wolny trastuzumab nie wykazuje takiego działania. W modelu in vivo leczenie prowadziło do redukcji przerzutów do płuc oraz obniżenia ekspresji kluczowych markerów molekularnych związanych z progresją nowotworu (pERK1/2, vimentyna, Axl). Mechanizm działania obejmuje blokowanie heterodimeru Her2/Axl oraz indukcję przejścia mezenchymalno-nabłonkowego (MET), co hamuje fenotyp przerzutowy komórek nowotworowych. Eliminacja komórek macierzystych nowotworowych przez Tzm-PEG-PHis może zapobiegać nawrotom i oporności na leczenie. Odkrycie to otwiera perspektywę rozszerzenia terapii trastuzumabem na pacjentki z Her2-negatywnym rakiem piersi, jednak konieczne są dalsze badania z użyciem większej liczby modeli przedklinicznych oraz badania kliniczne oceniające bezpieczeństwo i skuteczność u pacjentek.